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  • 对莽草酸分离纯化的工艺论述

    对莽草酸分离纯化的工艺论述
       1洗脱液的脱色和脱盐
        由于色素成分复杂,所以往往以相对值来表示,通常的做法是将料液在各波长扫描,找出其中最大吸收峰的位置,以此波长处的吸光值变化作为脱色效果的考察依据[8]。脱色率(%)=[(A0-A)/A0]×100%式中:A0:吸附前的吸光值;A:吸附后的吸光值。棕黄色的莽草酸发酵液洗脱后为棕黄色,需进行脱色。本实验选用HZ-816大孔吸附树脂进行动态脱色,根据洗脱液的量和树脂的吸附能力来确定吸附树脂的用量,控制流速。鉴于洗脱液中含有大量氯化铵,会影响莽草酸结晶,故需脱盐。本实验选择H型732强酸性阳离子交换树脂进行脱盐,根据洗脱液的量计算NH+4的浓度范围,再根据732树脂对NH+4的交换容量计算732树脂的用量,控制流速,进行脱盐。
        2莽草酸结晶和纯度检测
        2.1莽草酸结晶
        莽草酸溶解度为180mg/mL,根据洗脱液浓度计算饱和体积为4mL,将洗脱液旋转蒸发至莽草酸饱和体积,取出倒入平皿,在4℃下结晶。将结晶和剩余少量浓缩液分开,冰乙醇洗涤,结晶后再以少量热水溶解,进行再结晶。
        2.2莽草酸纯度检测
        将莽草酸结晶配制成300mg/L溶液,采用HPLC检测其纯度[9]。实验所用HPLC柱为4.6mm×250mmODS-2柱,流动相是纯净水(以H3PO4调节pH至2.0);体积流量为0.8mL/min;检测波长为217nm;柱温为28℃;进样量为20μL。
        3结果
        3.1阴离子交换树脂的筛选
        由于莽草酸的pKa为3.87±0.6,所以在pH大于4.87时,莽草酸在溶液中均呈阴离子状态,所以本实验选择以强碱性阴离子交换树脂对其进行吸附。如图1所示,4种树脂对莽草酸的吸附能力各不相同,尤以717强碱性阴离子交换树脂吸附容量最大。因此,本实验选用717强碱性阴离子交换树脂进行大肠杆菌DHPYAAS-T7发酵液中莽草酸的分离纯化。
        3.2pH值对阴离子树脂交换容量的影响
        在不同pH条件下,莽草酸会存在分子、部分解离或完全解离等不同状态,所以pH值对于离子交换树脂吸附目的产物的影响极大。本实验选用3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.07个不同pH值来考察717强碱性阴离子交换树脂吸附莽草酸的最适pH。由图2可见,当pH值为6.0时,莽草酸吸附量达到最大。莽草酸pKa为3.87±0.6,在pH值为6时,莽草酸是呈完全解离状态存在,能被717强碱性阴离子交换树脂完全吸附。
        3.3717树脂对莽草酸的动态吸附及洗脱曲线
        将经过预处理并调节pH值至6.0的发酵液进行动态吸附,层析柱规格为3.0cm×30cm,717树脂湿树脂的装填量为120mL(100g湿树脂),发酵浓缩液上样浓度6.46g/L,体积流量为2mL/min,每一个试管的收集时间为5min,吸附至饱和,绘成动态吸附曲线(图3)。吸附饱和后,以去离子水冲洗柱床除杂,再以浓度为1.0mol/L的NH4Cl进行洗脱,体积流量为2mL/min,得到洗脱曲线(图4)。收集15~40管,共计160mL,测定莽草酸含量为4.99g/L,回收率为91.7%。
        3.4洗脱液脱色及脱盐
        将前面所述160mL收集液输入脱色柱中,层析柱规格为2.0cm×30cm,HZ-816大孔吸附树脂用量为55mL,体积流量为2mL/min,每一个试管的收集时间为5min。脱色曲线如图5所示。将脱色液收集,共获得190mL脱色液,莽草酸浓度为4.15g/L,回收率为98.8%。再将脱色液以一定流量输入732阳离子树脂脱盐柱中,层析柱规格为3.0cm×30cm,732树脂的装填量为120mL(90g),体积流量为2mL/min,每管收集时间5min,当出口处流出液pH呈酸性时开始收集,共获得248mL体积,莽草酸浓度为3.16g/L,回收率为98.3%。
        3.5莽草酸结晶和纯度检测
        经脱色、脱盐后,将收集的莽草酸洗脱液进行结晶,获得晶体408mg,进行HPLC测定纯度,如图6所示,该样品纯度为98.6%。
        4讨论
        通过植物提取莽草酸的技术已经成熟,但生产工艺复杂,成本较高。我们实验室构建了一株高产莽草酸的基因工程菌(大肠杆菌DHPYAAS-T7)来生物合成莽草酸,似乎未见有报道。离子交换树脂提取分离技术所用设备简单,操作方便,生产连续化程度高,且对浓度低的样品也能富集,得到的产品往往纯度高,且树脂能多次循环使用,成本低。文献报道在植提莽草酸时使用717强碱阴离子树脂进行吸附,效果较好[10]。一般认为强碱性阴离子交换树脂对样品溶液pH没有要求,但本实验发现:莽草酸溶液pH大于6.0时,717阴离子交换树脂吸附量最大。其原因可能是pH大于6.0时,莽草酸才能完全电离成负离子,这样更容易与树脂的阴离子交换。洗脱后的发酵液仍是棕黄色,我们选用HZ-816大孔吸附树脂以除去大量的色素,洗脱液中可能存留洗脱剂NH4Cl,我们选用732阳离子树脂脱盐,脱色及脱盐回收率均较高。
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